ポリアクリルアミドゲルの調製～電気泳動までの流れ
（SDS-PAGE）
Laemmli法
Tris-Tricine SDS-PAGEのゲル組成，泳動バッファー組成は「Tris-Tricine SDS-PAGE」をご覧下さい。
準備する試薬
＜ポリアクリルアミドゲル＞
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1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)
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0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)
-
30％ アクリルアミド/ビス溶液：冷暗所保存
-
10％ SDS (sodium dodecyl sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム)
-
10％ APS (ammonium persulfate：過硫酸アンモニウム)：用事調製
-
TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl ethylenediamine)
＜泳動バッファー＞
-
Tris-Glycine SDS buffer：25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1％ SDS
＜2×サンプルバッファー (レムリバッファー)＞
-
125 mM Tris-HCl（pH6.8）, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol（もしくは200 mM DTT）, 0.02% BPB
試薬の調製
| 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) | トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：18.2 g 超純水に溶解、塩酸（HCl）でpH 8.8に調整し、100 mLとする |
|---|---|
| 0.5M Tris-HCl (pH 6.8) | トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：6.1 g 超純水に溶解、塩酸（HCl）でpH 6.8に調整し、100 mLとする |
| 30％アクリルアミド／ビス溶液（C：5％） ※冷暗所保存 |
アクリルアミド：28.5 g ※アクリルアミドの取り扱いには十分注意すること N,N’-メチレンビスアクリルアミド：1.5 g 超純水に溶解し、100 mLとする この溶液を0.22～0.45 μmのフィルターで吸引ろ過する |
| 10％ SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：10 g 超純水に溶解し、100 mLとする |
| 10％ APS (Ammonium Persulfate) ※用時調製 |
APS (Ammonium Persulfate)：0.1 g 超純水1 mLに溶解する |
| 10×Tris-Glycine SDS buffer ※使用時は超純水で10倍希釈する |
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：30.28 g Glycine：144.13 g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：10 g 超純水に溶解し、1 Lとする（pH調整は不要） |
| 2×サンプルバッファー ※ストック溶液は分注して-80℃で保存 |
0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)：2.5 mL 10％ SDS：4 mL グリセロール：2 mL 2-メルカプトエタノール：1 mL（もしくはDTT：0.3 g） 1％ BPB溶液：0.2 mL 超純水で溶解し、10 mLとする |
手順
①プレートの組み立て
プレート，コーム，シールガスケットは70％ エタノールで清拭してから組み立てる。
汚れているとゲルがうまく固まらず，きれいな泳動像が得られない。
プレート，コーム，シールガスケットは70％ エタノールで清拭してから組み立てる。
汚れているとゲルがうまく固まらず，きれいな泳動像が得られない。
②分離ゲル溶液の調製
泡立たないように注意しながらゲル溶液を混合する。重合開始剤であるAPSは最後に加える。
表1．分離ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
| 分離ゲル濃度 | 6％ | 7.5％ | 10％ | 12.5％ | 15％ |
|---|---|---|---|---|---|
| 超純水（mL） | 8.05 | 7.3 | 6.05 | 4.8 | 3.55 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | 3.75 | 3.75 | 3.75 | 3.75 | 3.75 |
| 30％ アクリルアミド／ビス溶液 | 3.0 | 3.75 | 5.0 | 6.25 | 7.5 |
| 10％ SDS | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
| TEMED | 0.00375 (3.75 μl) | 0.00375 (3.75 μl) | 0.00375 (3.75 μl) | 0.00375 (3.75 μl) | 0.00375 (3.75 μl) |
| 10％ APS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
③分離ゲルの重合（1時間以上）
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調製した分離ゲル溶液をプレートに注ぐ
-
注いだ分離ゲル溶液の上に蒸留水を静かに重層する
-
ゲルが固まるまで静置する（ゲル溶液のあまりでゲル化具合を確認できる（酸素との接触に注意する））
分離ゲル濃度が高い場合は，蒸留水ではなく，水飽和1-ブタノールを重層するときれいな境界面が得られる。
（水飽和1-ブタノールの調製：50 mLチューブ等に適量の水（例：20 mL）と適量の1-ブタノール （例：20 mL）を入れ激しく混合する。静置によって2層に分かれた上層を使用する。）
④濃縮ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
泡立たないように注意しながらゲル溶液を混合する。重合開始剤であるAPSは最後に加える。
表2．濃縮ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
| 分離ゲル濃度 | 3％ | 4％ | 5％ |
|---|---|---|---|
| 超純水（mL） | 3.9 | 3.7 | 3.5 |
| 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 30％ アクリルアミド／ビス溶液 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 10％ SDS | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
| TEMED | 0.003 (3 μl) | 0.003 (3 μl) | 0.003 (3 μl) |
| 10％ APS | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
⑤濃縮ゲルの重合（1時間以上）
-
重層した蒸留水またはを水飽和1-ブタノールを取り除く
-
調製した濃縮ゲル溶液を注ぐ
-
空気が入らないように注意しながらコームを挿し込む
-
ゲルが固まるまで静置する（ゲル溶液のあまりでゲル化具合を確認できる（酸素との接触に注意する））
-
ゲルを保管する場合は、チャック付き袋やラップで包み4℃で保管する（さらに蒸留水で湿らせたワイパーを入れることで乾燥を防ぐことができる）
⑥試料の調製
-
分析するタンパク質溶液と 2×サンプルバッファーを1:1で混合する
-
95℃で5分間加熱した後、氷上に置く
⑦泳動槽へゲルをセット
-
シールガスケット、クリップを外す
-
泳動槽へゲルをセットする
-
泳動バッファーを注ぐ
-
コームを外す
泳動の乱れを防止するために，ゲル板の下の気泡をしっかり除去すること。
⑧電気泳動
タンパク質分子量マーカー，調製した試料をロードし，泳動スタート。
・ロードする直前にウェルをピペッターなどで軽く洗浄し，ゲルの破片などの泳動の妨げとなるものを取り除く。
・ゲルの両端のレーンは泳動が乱れやすいのでなるべく使用しない。
・使用しないウェルに1×サンプルバッファーをロードするときれいに泳動できる。
・ロードする試料の液量を揃えるときれいに泳動できる。
・ローディングチップなどを用いてウェルの底にロードするときれいに泳動できる。
・ロードする直前にウェルをピペッターなどで軽く洗浄し，ゲルの破片などの泳動の妨げとなるものを取り除く。
・ゲルの両端のレーンは泳動が乱れやすいのでなるべく使用しない。
・使用しないウェルに1×サンプルバッファーをロードするときれいに泳動できる。
・ロードする試料の液量を揃えるときれいに泳動できる。
・ローディングチップなどを用いてウェルの底にロードするときれいに泳動できる。
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⑨バンドの確認
CBB染色や銀染色によりバンドを確認する。またはウエスタンブロッティングなどの次の実験に進む。
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準備する試薬
＜ポリアクリルアミドゲル＞
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49.5％ アクリルアミド/ビス溶液（C:3% )：冷暗所保存
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3 M Tris-HCl（pH 8.45）, 0.3％ SDS
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10％ APS（ammonium persulfate：過硫酸アンモニウム）
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TEMED（N,N,N’,N’-tetramethyl ethylenediamine）
＜泳動バッファー＞
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陽極側バッファー：0.1 M Tris-HCl（pH 8.9）
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陰極側バッファー：0.1 M Tris, 0.1 M Tricine, 0.1 M SDS
＜4×サンプルバッファー (レムリバッファー)＞
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150 mM Tris-HCl（pH7.0）, 12% SDS, 6% 2-mercaptoethanol（もしくは400 mM DTT）, 30% Glycerol, 0.05% CBB
試薬の調製
| 49.5％ アクリルアミド／ビス溶液（C：5％） ※冷暗所保存 |
アクリルアミド：48 g ※アクリルアミドの取り扱いには十分に注意すること N,N’-メチレンビスアクリルアミド：1.5 g 超純水に溶解し、100 mLとする この溶液を0.22～0.45 μmのフィルターで吸引ろ過する |
|---|---|
| 3M Tris-HCl (pH 8.45), 0.3％ SDS | トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：36.4 g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：0.3 g（0.3％） 超純水に溶解、塩酸（HCl）でpH 8.45に調整し、100 mLとする |
| 10％ APS (Ammonium Persulfate) ※用時調製 |
APS (Ammonium Persulfate)：0.1 g 超純水1 mLに溶解する |
| 10×陽極側バッファー ※使用時は超純水で10倍希釈する |
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：121.14 g 超純水に溶解、塩酸（HCl）でpH 8.9に調整し、1 Lとする |
| 10×陰極側バッファー ※使用時は超純水で10倍希釈する |
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）：121.14 g Tricine：179.17 g SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：10 g 超純水に溶解し、1 Lとする（pH調整は不要） |
| 4×サンプルバッファー ※ストック溶液は分注して-80℃保存する |
0.5 M Tris-HCl (pH 7.0)：3 mL SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)：1.2 g グリセロール：3 mL 2-メルカプトエタノール：0.6 mL（もしくはDTT 0.6g） 1％ CBB溶液：0.5 mL 超純水で溶解し、10 mLとする |
手順
①プレートの組み立て
プレート，コーム，シールガスケットは70％ エタノールで清拭してから組み立てる。
汚れているとゲルがうまく固まらず，きれいな泳動像が得られない。
プレート，コーム，シールガスケットは70％ エタノールで清拭してから組み立てる。
汚れているとゲルがうまく固まらず，きれいな泳動像が得られない。
②分離ゲル溶液の調製
泡立たないように注意しながらゲル溶液を混合する。重合開始剤であるAPSは最後に加える。
表3．分離ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
| 分離ゲル濃度 | 16.5％ |
|---|---|
| 超純水 | 7.6 mL |
| 3M Tris-HCl (pH 8.45), 0.3％ SDS | 10 |
| 49.5％ アクリルアミド／ビス溶液 | 10 |
| グリセロール | 2.4 |
| TEMED | 0.01（10 μl） |
| 10％ APS | 0.1 |
③分離ゲルの重合（1時間以上）
-
調製した分離ゲル溶液をプレートに注ぐ
-
注いだ分離ゲル溶液の上に蒸留水を静かに重層する
-
ゲルが固まるまで静置する（ゲル溶液のあまりでゲル化具合を確認できる（酸素との接触に注意する））
分離ゲル濃度が高い場合は，蒸留水ではなく，水飽和1-ブタノールを重層するときれいな境界面が得られる。
（水飽和1-ブタノールの調製：50 mLチューブ等に適量の水（例：20 mL）と適量の1-ブタノール （例：20 mL）を入れ激しく混合する。静置によって2層に分かれた上層を使用する。）
④濃縮ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
泡立たないように注意しながらゲル溶液を混合する。重合開始剤であるAPSは最後に加える。
表4．濃縮ゲル溶液の調製（ミニゲル2枚の場合）
| 濃縮ゲル濃度 | 4％ |
|---|---|
| 超純水 | 8 mL |
| 3M Tris-HCl (pH 8.45), 0.3％ SDS | 3 |
| 49.5％ アクリルアミド／ビス溶液 | 1 |
| TEMED | 0.009（9 μl） |
| 10％ APS | 0.09 |
⑤濃縮ゲルの重合（1時間以上）
-
重層した蒸留水またはを水飽和1-ブタノールを取り除く
-
調製した濃縮ゲル溶液を注ぐ
-
空気が入らないように注意しながらコームを挿し込む
-
ゲルが固まるまで静置する（ゲル溶液のあまりでゲル化具合を確認できる（酸素との接触に注意する））
-
ゲルを保管する場合は、チャック付き袋やラップで包み4℃で保管する（さらに蒸留水で湿らせたワイパーを入れることで乾燥を防ぐことができる）
⑥試料の調製
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分析するタンパク質溶液と 4×サンプルバッファーを3:1で混合する。
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95℃で5分間加熱*1した後，氷上に置く
*1 SDS存在下において加熱すると凝集するタンパク質は，40℃で30～60分とする。
⑦泳動槽へゲルをセット
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シールガスケット、クリップを外す
-
泳動槽へゲルをセットする
-
泳動バッファーを注ぐ*2
-
コームを外す
*2 下部バッファー槽に陽極側バッファーを，上部バッファー槽には陰極バッファーをそれぞれ注ぐ。
泳動の乱れを防止するために，ゲル板の下の気泡をしっかり除去すること。
⑧電気泳動
タンパク質分子量マーカー，調製した試料をロードし，泳動スタート。
・ロードする直前にウェルをピペッターなどで軽く洗浄し，ゲルの破片などの泳動の妨げとなるものを取り除く。
・ゲルの両端のレーンは泳動が乱れやすいのでなるべく使用しない。
・使用しないウェルに1×サンプルバッファーをロードするときれいに泳動できる。
・ロードする試料の液量を揃えるときれいに泳動できる。
・ローディングチップなどを用いてウェルの底にロードするときれいに泳動できる。
オススメ！
お求めやすい価格の着色済みマーカー MultiColor Stable (#DM670)
⑨バンドの確認
CBB染色や銀染色によりバンドを確認する。またはウエスタンブロッティングなどの次の実験に進む。
オススメ！
CBB染色の時間を短縮したい，酢酸の刺激臭が苦手という方はこちら！
酢酸・アルコールフリー，短時間かつ高感度にCBB染色できるQuickBlue Staining Solution (#DS500)
オススメ！
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