低温性細菌由来アルカリフォスファターゼ
Alkaline Phosphatase from psychrophilic bacterium
DNAを脱リン酸化後、容易に熱失活でき、速やかにライゲーション反応できます。
BAPとCIAPの長所を併せ持つ、低温性細菌由来アルカリフォスファターゼです。
低温細菌由来なのでSAPやCIAPと同様に、使用後に容易に熱失活性できるため、速やかにライゲーション反応に移れます。
一方、BAPはフェノール処理でも容易には失活しません。
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60℃では37℃の約4倍の活性を示すのでBAPと同様、DNAの末端構造（平滑末端や3’突出末端）にかかわらず60℃、30分間の処理によりDNA末端を脱リン酸化できます。
（一方、CIAPやSAPは60℃では急激に失活性してしまいます。）
ダイナザイム
商品
コード
商品名
※1
価格
製品
マニュ
アル
MSDS
※2
DE110
Alkaline Phosphatase (PAP)
from Shewanella.sp.
15,000円
※1
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※2
MSDS該当商品はMSDSがダウンロードできます。
PAPの利点
PAPは容易に熱失活できるが、BAPはフェノールでも容易には失活しない。
図に示されているように、BAP処理した場合は、得られる白色コロニー数が、PAPに比べ少なくなっている。これは脱リン酸化後の失活操作にもかかわらず活性を有するBAPが残存してしまい、インサートDNA側からもリン酸基を奪い取ってしまうためである。PAPは熱処理でもフェノール処理でも容易に完全に失活できるが、BAPはフェノール処理でも容易には失活せず、クローニング効率にまで影響を及ぼすことがある。BAPを用いる際は、残存するBAPを考慮して、ライゲーション反応時により多くのインサートDNA を加えるか、失活操作時に2回以上のフェノール処理を行わなくてはならない。
実験方法；
Eco
RI消化した1μg のpBluescript SK (+)ベクターを0.5 unitのBAPあるいは5 unitのPAPで脱リン酸化処理を行った。脱リン酸化反応後、反応溶液を以下の処理に躯した。
1.
No-treatment:
脱リン酸化反応溶液を失活処理せずに直接ライゲーション反応に用いた。
2.
Phenol:
脱リン酸化反応溶液に等量のフェノールを加え、30秒間ボルテックスした。エーテル抽出、エタノール沈殿後、沈殿を乾燥させ、滅菌水を加えて再溶解した。この水溶液をライゲーション反応に用いた。
3.
Heat:
脱リン酸化反応溶液を熱失活処理しただけで直接ライゲーション反応に用いた。なおPAPの場合95℃ 5分、BAPの場合は100℃ 5分処理した
これらの失活処理の後、 pBluescript SK (+) ベクターに約1kbのインサートDNAを加えてライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、XL1-Blueにトランスフォームした。図には、プレート上の白色コロニー数が示してある。
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